Usulan Penelitianku

• Tugas akhir merupakan syarat kelulusan untuk memperoleh gelar dari perguruan tinggi. Sebagai mahasiswa tingkat akhir, aku pun diwajibkan untuk menyelesaikan tugas akhirku jika ingin lulus. Di departemenku, yaitu Biokimia S1 IPB, ada beberapa tahapan yang harus dilalui. Yang pertama yaitu menyusun usulan penelitian lalu mempresentasikannya dihadapan dosen pembimbing (2), dosen penguji (1) dan 10 orang minimal rekan sesama mahasiswa. Setelah selesai melakukan penelitian, tahapan berikutnya yaitu seminar hasil penelitian dengan syarat yang sama seperti  kolokium. Jika skipsi kita sudah jadi dan selesai direvisi oleh dosen pembimbing (di acc dengan mendapatkan ttd pengesahan), skripsi kita lalu diperiksa oleh dosen lainnya, atau disebut kelayakan. Jika sudah dianggap layak, tahapan selanjutnya adalah sidang, dimana kita diuji oleh tiga orang dosen dan saat itulah langsung ditentukan apakah kita lulus siding atau perlu mengulang. Jika lulus maka kita dapat bernapas lega, dan selanjutnya tinggal mengurus administrasi hingga dapat SKL (surat kelulusan) , lalu wisuda deh, sesuatu hal yang diimpikan oleh setiap mahasiswa untuk disaksikan kedua orang tua dan keluraga. Namun wisuda ini bersifat sunnah sih aka ga wajib, karena secara teknis kita sudah lulus dengan adanya SKL, tapi seringkali orang awam yang tidak tahu menganggap bahwa lulusnya seorang mahasiswa dari suatu perguruan tinggi adalah jika sudah wisuda. Yah begitulah… tapi semoga saja saya bisa wisuda secepatnya yah, (aamiiin).
  Pada awal Februari (ketika aku sudah menginjak semester delapan) aku mendapatkan rekomendasi dari kaka kelas dan akhirnya mengajukan diri untuk melakukan penelitian di laboratorium Bioproses dan Fermentasi, Bioteknologi-LIPI Cibinong dengan mengerjakan salah satu proyek mereka. Dan Alhamdulillaah pada Hari Senin 15 April 2013 lalu aku telah berhasil melalui satu tahapan dalam rangka mencapai kelulusanku, yaitu kolokium. Hingga saat ini, tertanggal 20 November 2013 (dan aku sudah memasuki semester ke-9), aku belum ditakdirkan untuk melalui tahapan keduaku, yaitu seminar dikarenakan sesuatu hal (kapan-kapan aku ceritakan pada kalian ya). Sekarang aku ingin menunjukkan usulan penelitianku yang aku kolokiumkan (maaf, ada sedikit bagian yang tidak ku masukkan).
  Usulan Penelitian
  
  
  OPTIMASI PRODUKSI OLIGOSAKARIDA
  DARI KARBOHIDRAT UMBI TACCA MENGGUNAKAN ENZIM AMILASE DARI Brevibacterium sp.
  
  
  FEBY HERYANI PUTRI
  
  
  
  
  
  
  
  DEPARTEMEN BIOKIMIA
  FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
  INSTITUT  PERTANIAN BOGOR
  BOGOR
  2013
  
  

  PRAKATA

  Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan usulan penelitian yang berjudul “Optimasi Produksi Oligosakarida dari Karbohidrat Umbi Tacca Menggunakan Enzim Amilase dari Brevibacterium sp.”. Usulan penelitian ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memeroleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia.
  Rasa terimakasih penulis sampaikan kepada ibu Dr. Mega Safithri, M.Si selaku dosen pembimbing utama dari Departemen Biokimia dan ibu Nanik Rahmani, M. Si selaku pembimbing kedua dari Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI yang telah memberikan banyak arahan, bimbingan, dan motivasi kepada penulis. Tak lupa penulis juga menyampaikan terimakasih kepada keluarga, teman-teman di Departemen Biokimia angkatan 46, sahabat-sahabat di Pondok Asad serta semua pihak yang telah turut memberikan dukungan, motivasi, dan doa.
     Penulis menyadari bahwa usulan penelitian ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk memperbaiki usulan penelitian ini dalam rangka pelaksanaan penelitian.
  Bogor, Maret 2013
  
  
  Feby Heryani Putri

  PENDAHULUAN

  Latar Belakang

  Oligosakarida merupakan salah satu produk hidrolisis (hidrolisat) pati yang banyak dikembangkan dan dimanfaatkan dalam berbagai bidang diantaranya bidang kimia, kosmetik, farmasi dan  pangan, seperti pembuatan sirup (Aiyer 2005). Akan tetapi sebagian besar kebutuhan pati termodifikasi di Indonesia masih dipenuhi produk impor. Nilai impor pati termodifikasi ke Indonesia diperkirakan mencapai US$ 150 juta setiap tahunnya (Tjahyono 2004). Sebetulnya dengan keanekaragaman sumber daya alam yang ada, Indonesia memiliki potensi yang besar untuk memenuhi kebutuhan tersebut. Indonesia memiliki banyak tanaman yang merupakan sumber karbohidrat seperti umbi-umbian. Tacca merupakan salah satu diantara umbi-umbian tersebut yang merupakan sumber karbohidrat dan belum banyak dikenal serta belum dikembangkan.
  Tacca (Tacca leontopetaloides) adalah salah satu sumber karbohidrat alternatif yang tumbuh di daerah tropis serta banyak dijumpai di daerah pesisir dan bersalinitas tinggi. Penyebaran tumbuhan ini meliputi wilayah tropis Asia, Australia, dan Afrika. Tumbuhan ini tumbuh liar atau kadang-kadang dibudidayakan mulai dari bagian barat Afrika, India, lalu Asia Tenggara, sampai ke bagian timur kepulauan Pasifik (Manek et al. 2005). Tacca ditemui tumbuh liar di seluruh wilayah pesisir Indonesia, misalnya di Kepulauan Karimunjawa dan di daerah pesisir Garut Selatan dengan nama lokal jalawure. Tacca juga banyak di jumpai di daerah Kabupaten Kepulauan Talaud khususnya di Kecamatan Nanusa, Sulawesi Utara dengan nama lokal Anuwun. Tumbuhan ini masih merupakan tanaman liar karena belum dibudidayakan oleh masyarakat setempat. Pengembangan umbi Tacca ini masih sangat terbatas, seperti di kampung Cigadog Kecamatan Cikelet Garut, Tacca telah dimanfaatkan untuk dikonsumsi masyarakat sebagai bahan pangan alternatif pengganti beras. Tepung Tacca digunakan untuk membuat berbagai jenis kue, baik kue kering maupun kue basah (Aatjin  2012).
  Kandungan umbi segar tacca adalah 2-3% kulit, 6-7% serat  20-30% pati dan 60-70% bahan cair. Komposisi proksimat dari daging umbi adalah protein 1,10-1,50%, abu 2,70-2,73%, 0,28-0,68% serat, lemak 0,08-0,10% dan 89.4% karbohidrat. Selain itu, tacca juga mengandung 3,15-3,58% ekstrak flavonoid kasar (Ukpabi et al. 2009).
              Salah satu bentuk pengembangan umbi tacca yaitu dengan memproduksi oligosakarida dari karbohidrat umbi tersebut secara enzimatis menggunakan enzim amilase dari Brevibacterium sp. Proses hidrolisis tersebut perlu dilakukan pada kondisi yang optimum agar diperoleh hasil yang optimum pula.
  Rumusan Masalah
  Permasalahan dari penelitian ini yaitu kondisi optimum aktivitas enzim amilase dalam menghidrolisis karbohidrat sehingga menghasilkan oligosakarida. Variabel yang digunakan yaitu konsentrasi substrat, perbandingan konsentrasi enzim dan substrat, suhu serta waktu.

  Tujuan

  Tujuan penelitian ini ada tiga, yaitu pertama memproduksi enzim amilase ekstrak kasar dari Brevibacterium sp. Enzim yang diperoleh ini digunakan untuk menghidrolisis karbohidrat umbi Tacca. Kedua adalah menentukan kondisi optimum reaksi hidrolisis karbohidrat. Variabel yang digunakan yaitu konsentrasi substrat, perbandingan konsentrasi enzim dan substrat, suhu serta waktu. Ketiga yaitu analisis oligosakarida yang terdiri dari gula pereduksi, gula total, serta analisis menggunakan kromatografi lapis tipis (thin layer chromatography, TLC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC).

  Manfaat

  Manfaat penelitian adalah dapat menghasilkan enzim amilase ekstrak kasar dari Brevibacterium sp., dapat menentukan kondisi optimum hidrolisis enzimatik karbohidrat umbi Tacca baik konsentrasi substratnya, perbandingan konsentrasi enzim dan substrat, suhu serta waktu. Manfaat lainnya yaitu dapat mengetahui informasi mengenai jenis oligosakarida yang terdapat dalam hasil hidrolisis karbohidrat umbi Tacca dengan adanya analisis menggunakan TLC dan HPLC.
  Hipotesis
  Enzim amilase dapat dihasilkan dari Brevibacterium sp. yang ditumbuhkan dalam media tertentu yang menunjang dan sesuai. Selain itu, hidrolisis enzimatik karbohidrat umbi tacca berlangsung pada kondisi optimum dimana konsentrasi substrat berkisar antara 0.5% sampai 2.5%, perbandingan enzim dan substrat 1:1; 1:5; 1:10 atau 1:20, serta pada suhu 30-90°C. Oligosakarida yang dihasilkan dari proses hidrolisis karbohidrat umbi tacca tersebut tersusun dari berbagai jenis monosakarida seperti glukosa, galaktosa, maltosa dan maltotriosa.  
  Tempat dan waktu
  Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi Bidang Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong. Waktu penelitian yaitu  mulai bulan Maret 2013 s.d Juli 2013.
  
  

  TINJAUAN PUSTAKA

  Umbi Tacca

  Tacca (Tacca leontopetaloides) adalah salah satu sumber karbohidrat alternatif yang tumbuh di daerah tropis serta banyak dijumpai di daerah pesisir dan bersalinitas tinggi. Penyebaran tumbuhan ini meliputi wilayah tropis Asia, Australia, dan Afrika. Tumbuhan ini tumbuh liar atau kadang-kadang dibudidayakan mulai dari bagian barat Afrika, India, lalu Asia Tenggara, sampai ke bagian timur kepulauan Pasifik (Manek et al. 2005). Di Indonesia, umbi Tacca ditemui tumbuh liar di seluruh wilayah pesisir Indonesia, misalnya di daerah pesisir Garut Selatan dan di Kepulauan Karimunjawa (Aatjin  2012).
  Tacca merupakan salah satu jenis tumbuhan berbunga yang masih termasuk kedalam keluarga talas-talasan. Karakteristik tumbuhan ini  yaitu tidak berkayu, bercabang, memiliki bunga, berbiji, tangkai daun melekat pada batang dan daunnya berbentuk segi lima serta berkembangbiak melalui vegetatif (umbi) dan reproduktif (biji). Tacca termasuk ke dalam kingdom Plantae, kelas Liliopsida, filum Tracheophyta, ordo Liliales, famili Taccaceae dan spesies Tacca Leontopetaloides (Ukpabi et al. 2009). Adapun nama lokal Tacca di Garut adalah jalawure, sedangkan di Sulawesi Utara yaitu anuwun (Gambar 1) (Aatjin AZ 2012).
  
  Gambar 1 Tumbuhan dan umbi tacca (BKP Kabupaten Garut 2011)
  Umbi dan tepung Tacca kaya akan karbohidrat. Tacca menyimpan cadangan makanan dalam bentuk umbi di dalam tanah, dengan ukuran umbi bervariasi antara 1–2 kg. Menurut Badan Ketahanan Pangan Kabupaten Garut (2011) umbi tacca mengandung karbohidrat 38,16 gr/100 gr dan dalam bentuk tepung mengandung karbohidrat 83,07 gr/100 gr. Apabila dibandingkan dengan jenis tepung lainnya, tepung Tacca mengandung karbohidrat paling tinggi. Sedangkan menurut Ukpabi et al. (2009) kandungan umbi segar tacca adalah 2-3% kulit, 6-7% serat  20-30% pati dan 60-70% bahan cair. Komposisi proksimat dari daging umbi adalah protein 1,10-1,50%, abu 2,70-2,73%, 0,28-0,68% serat, lemak 0,08-0,10% dan 89.4% karbohidrat. Selain itu, tacca juga mengandung 3,15-3,58% ekstrak flavonoid kasar.

  Oligosakarida

  Menurut Winarno (2008) penggolongan karbohodrat terdiri dari tiga, yaitu monosakarida, oligosakarida dan polisakarida. Monosakarida merupakan karbohidrat paling sederhana karena molekulnya hanya terdiri atas beberapa atom C dan tidak dapat diuraikan dengan cara hidrolisis menjadi karbohidrat lain. Monosakarida dibedakan menjadi aldosa dan ketosa. Contoh dari aldosa yaitu glukosa dan galaktosa. Contoh ketosa yaitu fruktosa.
  Oligosakarida merupakan jenis karbohidrat yang memiliki 2-10 monomer monosakarida. Oligosakarida yang terdiri dari 2 molekul disebut disakarida, misalnya sukrosa (terdiri dari molekul glukosa dan fruktosa) dan laktosa (terdiri dari molekul glukosa dan galaktosa). Beberapa pemanfaatan oligosakarida yaitu di bidang kimia, kosmetik, farmasi dan  pangan, seperti pembuatan sirup (Aiyer 2005).
  Polisakarida merupakan polimer dari molekul-molekul monosakarida yang berantai lurus ataupun bercabang dan dapat dihidrolisis dengan menggunakan enzim yang memiliki cara kerja spesifik. Pati merupakan simpanan energi di dalam sel-sel tumbuhan. Pati ini berbentuk butiran-butiran kecil mikroskopik dengan diameter 5-50 nm. Di alam, pati banyak terkandung dalam beras, gandum, jagung, biji-bijian seperti kacang merah atau kacang hijau dan di dalam berbagai jenis umbi-umbian seperti singkong, kentang atau ubi. Di dalam berbagai produk pangan, pati umumnya terbentuk dari dua polimer molekul glukosa yaitu amilosa dan amilopektin. Amilosa merupakan polimer glukosa rantai panjang yang tidak bercabang sedangkan amilopektin merupakan polimer glukosa dengan susunan yang bercabang-cabang. Komposisi kandungan amilosa dan amilopektin ini akan bervariasi dalam produk pangan dimana produk pangan yang memiliki kandungan amilopektin tinggi akan semakin mudah untuk dicerna. Pati dapat dihidrolisis dengan asam (non enzimatis) atau dengan enzim (enzimatis). Hidrolisis nonenzimatis menggunakan asam sebagai katalisnya seperti HCl. Metode hidrolisis dengan asam membutuhkan pH 1-2, suhu yang tinggi (150-230°C), dan tekanan yang tinggi. Hidrolisis enzimatik dicirikan oleh laju reaksi yang tinggi, stabilitas yang tinggi melalui aksi denaturasi pelarut, detergen, enzim proteolitik, penurunan viskositas dari reaksi pada suhu tinggi, dan lain sebagainya. Kebanyakan hidrolisis enzimatik menggunakan enzim α-amilase dari berbagai sumber yang berbeda (Kolusheva dan Marinova 2006).
  Enzim Amilase
  Enzim adalah sekelompok protein yang berperan sebagai pengkatalis dalam reaksi-reaksi biologis. Enzim dapat juga didefenisikan sebagai biokatalisator yang dihasilkan oleh jaringan yang berfungsi meningkatkan laju reaksi dalam jaringan itu sendiri. Semua enzim yang diketahui hingga kini hampir seluruhnya adalah protein. Berat molekul enzim pun sangat beraneka ragam, meliputi rentang yang sangat luas yaitu berkisar antara 12.000 sampai lebih dari 1 juta (Lehninger 2008).
  Enzim digolongkan menurut reaksi yang diikutinya, sedangkan masing-masing enzim diberi nama menurut nama substratnya, misalnya urease, arginase dan lain-lain. Di samping itu ada pula beberapa enzim yang dikenal dengan nama lama misalnya pepsin, tripsin dan lain-lain. Oleh Commision on Enzymes of the International Union of Biochemistry, enzim dibagi dalam enam golongan besar. Penggolongan ini didasarkan atas reaksi kimia di mana enzim memegang peranan. Enam golongan tersebut ialah oksidoreduktase (mengkatalisis reaksi pemindahan elektron), transferase (pemindahan gugus fungsionil), hidrolase (reaksi hidrolisis), liase (penambahan gugus ke ikatan ganda atau sebaliknya), isomerase (pemindahan gugus di dalam molekul, meghasilkan bentuk isomer), dan ligase (pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O dan C-N oleh reaksi kondensasi yang berkaitan dengan penguraian ATP) (Poedjiadi 2006).
              Amilase adalah enzim yang dapat mengubah pati menjadi gula, serta tergolong hidrolase. Enzim ini dapat dihasilkan di dalam tubuh manusia, yaitu pada kelenjar ludah dan pankreas. Tumbuhan dan beberapa jenis bakteri juga dapat memproduksi enzim amilase. Enzim ini diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu α-amilase, β-amilase, dan γ-amilase. Nama lain α-amilase adalah 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase atau biasa juga disebut glycogenase. α-Amilase adalah jenis enzim amilase terbesar yang terkandung dalam tubuh manusia dan mamalia yang lain. Selain itu, α-amilase juga dapat ditemukan pada tumbuhan (barley), jamur (Ascomycetes dan Basidiomycetes), dan bakteri (Bacillus). Enzim α-amilase umumnya diisolasi dari berbagai mikroorganisme seperti Bacillus amyloquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, dan Aspergillus niger (Dirnawan 1999).

  TLC dan HPLC

  Metode yang dikembangkan dalam analisis karbohidrat adalah Kromatografi. Proses kromatografi digunakan dalam metode pemisahan komponen gula dari komponen non gula menjadi fraksi-fraksi terpisah yang diakibatkan oleh perbedaan adsorpsi, difusi dan eksklusi komponen gula dan non gula tersebut terhadap adsorben dan eluen yang digunakan. Jenis kromatografi yang biasa digunakan dalam memisahkan gula-gula sederhana adalah Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Cromatography, TLC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (High Performance Liquid Cromatography, HPLC) (Zou & Chen 2008).
  Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Cromatography, TLC) merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang fase diamnya diisi atau dikemas di dalamnya, pada TLC fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom. TLC terdiri dari fase gerak dan fase diam. Jel silika atau alumina merupakan fase diam. Fase diam untuk TLC seringkali juga mengandung substansi yang dapat berpendar dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida (Weston & Brokleblank 1999). Keuntungan TLC diantaranya yaitu penggunaannya lebih mudah dan murah, identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet, dan dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan banyak penelitian yang menggunakannya di laboratorium (Mort & Pierce 2002).
  Prinsip pemisahan HPLC sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya yaitu berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan dari 2 komponen yang berbeda fasenya (fase diam dan fase gerak). HPLC terdiri dari fase diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan, resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada temperatur rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fase (gerak dan diam). Migrasi dari molekul komponen akan sebanding dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya rendah (Du & Chen 2009).
  Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak HPLC merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC (Zou & Chen 2008).
  
  
  
  

  BAHAN DAN METODE

  Bahan dan Alat

  Bahan utama yang digunakan sebagai substrat yaitu pati hasil ekstraksi umbi tacca. Umbi tacca tersebut merupakan hasil kultur jaringan di Laboratorium Biak Sel dan Kultur Jaringan Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI. Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media peremajaan, pertumbuhan, dan produksi enzim amilase ekstrak kasar yaitu Artificial Sea Water (ASW), yeast extract, pepton, pati komersial (Merck), akuades, agar, dan isolat bakteri. Bahan-bahan lain yang digunakan untuk analisis kimia yaitu buffer fosfat pH 6.6 (0.2 M), pereaksi DNS (DNS, NaOH, Na-K tartrat), fenol 5% (b/v), H₂SO4 pekat, n-butanol, asam asetat, α-difenilamin, aseton, asam fosfat, dan anilin.
  Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan media peremajaan dan pertumbuhan bakteri yaitu erlenmeyer, cawan petri steril, magnetic stirrer, jarum ose steril, bunsen, laminar, alkohol 70%, dan plastik wrap. Alat-alat yang digunakan untuk produksi enzim amilase yaitu erlenmeyer, inkubator goyang, sumbat kapas, dan hot plate. Selain itu alat-alat yang digunakan untuk analisis kimia yaitu tabung reaksi, rak tabung, microtube ependorf, pipet mikro, sentrifus, stopwatch, waterbath, kuvet, spektrofotometer uv-vis, autoklaf, TLC dan HPLC.

  Metode

  Produksi enzim amilase ekstrak kasar (Rahmani et al. 2011)
  Pembuatan media peremajaan dan kultur penumbuhan bakteri
  Pembuatan media diawali dengan menyiapkan bahan penyusun media peremajaan dan kultur bakteri terlebih dahulu yang terdiri dari 38 g/l Artificial Sea Water (ASW), 2% pati komersial, 1.5% agar, 1 g/l yeast extract dan 5 g/l pepton. Media tersebut disterilisasi pada 121°C selama 15 menit. Peremajaan bakteri dilakukan pada cawan petri steril, sedangkan kultur pertumbuhan bakteri dilakukan pada media cair. Bahan yang digunakan pada media peremajaan dan kultur pertumbuhan bakteri hampir sama, hanya saja agar tidak ditambahkan pada media kultur pertumbuhan.
  Peremajaan dan proses kultur bakteri
  Peremajaan bakteri dilakukan dengan menggoreskan isolat bakteri menggunakan jarum ose steril pada media padat yang telah disiapkan. Media tersebut mengandung komponen nutrisi dan sumber karbon bagi pertumbuhan isolat bakteri. Sebelum melakukan penanaman, laminar tempat kerja disinari sinar UV terlebih dahulu selama 15 menit untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan sehingga dapat menurunkan risiko kontaminasi sebelum penanaman. Media yang telah ditanami isolat diinkubasi pada suhu 30°C selama 3 hari.
  Setelah itu dilakukan prekultur dan kultur isolat bakteri pada media cair. Prekultur dilakukan dengan memindahkan sebanyak 1 ose koloni tunggal bakteri ke dalam 20 ml media cair. Tujuan prekultur yaitu sebagai tahap adaptasi bakteri terhadap media pertumbuhan sebelum dilakukan kultur pada volume yang lebih besar yaitu 180 ml media cair. Prekultur diinkubasi pada inkubator goyang 150 rpm, 30°C selama 3 hari. Selanjutnya dilakukan proses kultur pada kondisi yang sama seperti pada prekultur. Satelah hari ke-4 kultur siap dipanen. 
  Preparasi enzim amilase ekstrak kasar
  Amilase ekstrak kasar didapatkan dari ekstraksi kultur sel dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 11000 rpm selama 15 menit. Ekstrasi enzim amilase dipertahankan pada suhu dingin yaitu minimal 4°C (Liu et al. 2011) untuk menjaga aktifitas enzim. Hasil ekstraksi enzim (supernatan) yang diperoleh merupakan amilase ekstrak kasar yang siap digunakan untuk proses hidrolisis.
  Analisis aktivitas amilase ekstrak kasar (modifikasi Bernfeld 1995)
  Aktivitas enzim amilase ditentukan dengan menggunakan metode DNS yang telah dimodifikasi (Bernfeld 1995) dengan mereaksikan 0.5 ml enzim yang telah diencerkan dengan faktor pengenceran tertentu dan 0.5 ml larutan pati 0.5% (b/v) dalam buffer fosfat  pH 6.6 (0.2 M), kemudian diinkubasi 30°C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan merendam tabung reaksi berisi sampel dalam air mendidih 100°C selama 20 menit. Gula pereduksi yang dibebaskan ditentukan dengan menggunakan metode DNS (Miller 1959). Warna yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh dikonversi  menjadi konsentrasi gula pereduksi (ppm) menggunakan persamaan yang didapat dari kurva standar glukosa. Satu unit aktivitas enzim (U) merupakan jumlah enzim yang mampu mengkatalis perubahan 1 µmol substrat per menit pada keadaan pengukuran optimal (Lehninger 2008). Rumus:
  Penentuan kondisi hidrolisis enzimatis pati umbi tacca (Rohanah 2012)
  Tahap ini merupakan tahap penentuan kondisi produksi oligosakarida dengan menggunakan enzim amilase ekstrak kasar. Terdapat tiga variabel yang harus ditentukan yaitu konsentrasi substrat b/v (0; 2.5; 5; 7.5%), perbandingan enzim-substrat v/v (1:1;1:5;1:10;1:20), suhu (30;50;70;90°C), serta waktu reaksi hidrolisis enzimatis (jam ke-0;2;4;6;8;24). Penentuan kondisi tersebut dilakukan secara bertahap.
  Proses reaksi hidrolisis enzimatis dilakukan dengan cara membuat larutan substrat terlebih dahulu dengan berbagai konsentrasi menggunakan pelarut akuades, lalu dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit dan didiamkan hingga suhunya mencapai 30°C. Selanjutnya dilakukan penambahan amilase ekstrak kasar sebanyak 1 ml dan disimpan pada inkubator goyang dengan berbagai variasi suhu. Pengambilan sampel dilakukanpada jam ke-0, 2, 4, 6, 8 dan 24. Sampel dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit, dan didiamkan hingga suhunya 27°C, lalu sentrifugasi pada kecepatan 11000 rpm selama15 menit dan supernatan yang dihasilkan selanjutnya dianalisis gula pereduksi, gula total, derajat polimerasi dan TLC. 
  Analisis kimia
  Analisis gula total (modifikasi Dubois et al. 1956)
  Analisis gula total ditentukan dengan menggunakan metode fenol-asam sulfat yang telah dimodifikasi (Dubois et al. 1956). Larutan glukosa standar masing-masing sebanyak 0.5 ml dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200 ppm dimasukkan ke dalam tabung reaksi, begitu juga sampel hasil hidrolisis. Sebanyak 0.5 ml larutan fenol 5% (b/v) dan 2.5 ml asam sulfat pekat ditambahakn ke dalam larutan standard an sampel kemudian diinkubasi pada suhu 40°C selama 20 menit. Setelah itu absorbansi diukur pada panjang gelombang 490 nm.
  Analisis gula pereduksi (modifikasi Miller 1959).
  Jumlah gula pereduksi yang terbentuk ditentukan dengan metode DNS yang telah dimodifikasi (Miller 1959). Sebanyak 0.5 ml larutan standar glukosa dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 500 ppm yang telah diencerkan dari 1000 ppm dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 0.75 ml pereaksi DNS, begitupun sampel hasil hidrolisis. Larutan standar sampel dimasukkan ke dalam waterbath 100°C selama 20 menit kemudian didiamkan sampai suhunya mendekati suhu ruang. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.
  Kromatografi Lapis Tipis (Rohanah 2012)
  Kromatografi Lapis Tipis digunakan secara kuantitatif untuk melihat jenis oligosakarida yang terbentuk. Analisis ini dilakukan pada plat silika gel 60 F₂₅₄ (Merck art 20-20 cm) sebagai fase diam. Plat tersebut dibuat dengan ukuran 10 cm x 10 cm, garis start 1 cm dari batas bawah dan garis finish 0.5 cm dari batas atas. Sampel diteteskan sebanyak 8 kali menggunakan pipa kapiler dengan jarak 1 cm antara sampel. Plat dimasukkan ke dalam bejana pengembang berisi eluen yang telah dijenuhkan selama 1 jam. Eluen tersebut terdiri dari n-butanol:asam asetat:akuades dengan perbandingan 12:6:6 (ml). Elusi dilakukan hingga garis finish. Plat diangkat hingga eluen menguap semua pada suhu kamar lalu  disemprotkan dengan pewarna gula (0.5 gram α-difenilamin, 25 ml aseton, 2.5ml asam fosfat, 0.5 ml aniline pada erlenmeyer 300 ml). Plat dikeringkan didalam oven 100°C selama 15 menit hingga terbentuk spot. Setelah dingin diukur nilai Rf dari masing-masing komponen. Nilai Rf adalah perbandingan tinggi spot pada plat silika gel dengan tinggi larutan pengembang. Rumusnya yaitu:
  
  Analisis profil oligosakarida menggunakan HPLC (Rohanah 2012)
  Oligosakarida hasil hidrolisis enzimatis dianalisis secara kualitatif maupun kuantitatif menggunakan HPLC. Detektor yang digunakan yaitu Refractive Index Detector (RID) dan kolom Zorbax SIL (silika) dengan dilapisi 3-aminopropilsilen. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril dan akuades dengan rasio 75:25 (v/v) yang telah di-degassing. Kecepatan alir dan suhu yang digunakan adalah 1.4 ml/menit dan 30°C (Lee et al. 2003, Kandra et al. 2002).
  
  
  DAFTAR PUSTAKA
  Aiyer PV. 2005. Amilases and their application. J Biotechnol 4 (13): 1525-1529.
  Bernfeld P. 1955. Amilase α- and β-Methodes. J Anzymol: 149-158.
  [BKP] Badan Ketahanan Pangan Kabupaten Garut. 2011. Jalawure Tumbuhan Liar Sumber Pangan Alternatif. [terhubung berkala]: http://www.garutkab.go.id/pub/news/detail/7553jalawuretumbuhan-liar-sumberpangan-alternatif.html (28 Februari 2013).
  Dirnawan H. 1999. Isolasi Bakteri Termofil Penghasil Enzim Hidrolitik dari Sumber Air Panas Gunung Pancar. [Skripsi]. Bogor: IPB.
  Du H, Chen XQ (2009). Comparative study of the separation ofoleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris by High Performance Liquid Chromatography and Cyclodextrin-Modified Micellar Electrokinetic Chromatography. J. Iran Chem. Soc., 6(2):334-340.
  Dubois, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Colorimetric method for determination of sugar and related substance. J Anal Chem 28: 350-356.
  Kandra L, Gyemant G, Liptak A. 2002. Action pattern of α-amilases on modified maltooligosaccharides. J Biol 57 (11):171-180.
  Kolusheva T, Marinova A. 2006. A study of the optimal condition of starch hidrolisis through thermostable α-amilase. J Univ Chem Technol Metal. 42(1):93-96
  Lee JW, Kwon TO, Moon IS. 2003. Adsorption of monosaccharides, disaccharides, and maltooligisaccharides on activated carbon for separation of maltopentaose. Biotechnol Bioprocess Engineer 8: 47-53.
  Liu J, Zhang Z, Zhu H, Dang H, Lu J, CuiZ. 2011. Isolation and characterization of α-amilase from marine Pseudomonas sp. K6-28-040. J Biotechnol 10 (14): 2733 -2740.
  Lehninger AL. 2008. Dasar-dasar Biokimia, Jilid 1. Thenawidjaja M, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
  Manek RV, Kunle OO, Emeje MO, Builders P, Rama Rao GV, Lopez GP & Kolling WM. 2005. Physical, thermal and sorption profile of starch obtained from Tacca leontopetaloides. Starch 57: 55–61.
  Mort AJ, Pierce MC. 2002. Preparation of carbohydrates for analysis by modern chromatography and electrophrosis. Chromatogy Library 66:3-35.
  Poedjiadi A. 2006. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Pr.
  Rahmani N, Yopi, Indriani A, Awan. 2011. Karakteristik dan Pengembangan Karbohidrat dari Umbi Kentang Hitam (Coleus tuberosus Benth), Ubi Kayu (Manihot esculenta) [Laporan Teknis]. Bogor: Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
  Rahmani N, et al. 2011. Production and characterization of amilase anzyme from marine bacteria. Proceeding of the 2^nd International Seminar on Chemistry: 255-259.
  Tjahyono AE. 2004. Grand Strategy of The Development of Starch based Agro Industries. Symposium Direction of Starch Innovation, Bandung 26 Januari 2004.
  Ukpabi UJ, Ukenye E, Olojede AO. 2009. Raw Material Potentials of Nigerian Wild Polynesian Arrowroot (Tacca leontopetaloides) Tubers and Starch. Journal of Food Technology.7(4):135-138.
  Weston RJ, Brockleblank LK. 1999. The oligosaccharide composition of some New Zealand honeys. Food Chem 64:33-37.
  Zou S, Chen W (2008). Determination of oleanolic acid and ursolicacid in different parts of Perilla frutescens by High Performance Liquid Chromatography. J. Braz. Chem. Soc., 19(7): 1429-1432.
  
  
  
  
  
  
  Pada saat kolokium itulah aku mendapatkan banyak masukan, baik dari teman maupun dosen.  Beberapa masukan itu yaitu:
  1.       Manfaat penelitian kurang gambalang/ tujuan utama penelitian tidak clear.
  2.       Tidak terlalu menguasai bahan.
  3.       Pemaparan latar belakang tidak lengkap.
  4.       Pemaparan tinpus tidak menjurus pada aspek penelitian -> tidak lengkap.
  5.       Ada sumber yang disebutkan, namun tidak ada dalam dapus.
  6.       Tinpus oligosakarida seharusnya berisi pemanfaatan, penelitian terdahulu, produksi dari tacca.
  7.       Tinpus amylase seharusnya berisi tentang amylase yang spesifik untuk produksi oligosakarida apa saja -> sebaiknya tajam & gambalang dalam pemaparannya, amylase yang memproduksi oligosakarida telah diteliti siapa saja.
  8.       Tambahkan tinpus Brevibacterium.
  Selain itu, ada beberapa pertanyaan yang sebagian besar tidak bisa aku jawab:
  1.       Apakah oligosakarida hanya bisa didapat dari pati? Apakah hubungannya dengan pati termodifikasi?
  2.       Kenapa oligosakarida harus diproduksi?
  3.       Tujuan produksi/hidrolisis?
  4.       Manfaat jangka panjangnya apa?
  5.       Ada galaktosa, polisakaridanya apa?
  6.       Kenapa harus memakai bakteri itu?
  7.       Kenapa waktu inkubasinya seperti demikian?
  8.       Apakah media ASW, dan kenapa pakai media itu?
  9.       Apakah bakteri lain sudah dicoba?
  
  
  Sejujurnya saat itu aku sangat terpukul. Ingin menangis rasanya, tapi air mataku aku tahan dan tak ku biarkan tumpah saat itu. Karena tentu akan sangat memalukan jika ada seorang mahasiswa yang menangis ketika kolokium, hanya karena mendapat banyak masukan dari dosen. Saat itu aku menyadari betapa aku masih belum mengerti apapun tentang penelitianku itu. Sama sekali. Padahal aku telah mempelajarinya cukup lama (awal Februari-tengan April). Ternyata selama itu aku belajar, namun belum mencapai tahap pemahaman. Sempat terpikir olehku untuk berganti topik penelitian. Tapi setelah aku pertimbangkan, jika aku menggantinya, maka aku harus kembali belajar dan memulai dari awal, terlebih lagi aku tengah mengerjakan penelitian tahap awalnya. Maka aku putuskan untuk melanjutkannya, menyelesaikan apa yang telah aku mulai.
  Tak terasa sudah hampir tujuh bulan berlalu semenjak saat itu (terakhir kali aku ng’lab 2 minggu setelah kolokium).  Dan aku kembali dihadapkan untuk menyelesaikan apa yang telah aku mulai. Tapi aku rasa pengetahuanku tentang penelitianku masih belum bertambah cukup signifikan hingga saat ini. Dan waktu yang tersisa hanyalah kurang dari 20 hari lagi dari waktu yang ku rencanakan. Hwaaaa…….. bagaimana ini??? (Lalu, apa saja yang aku lakukan selama ini??? Kemana sajakah diriku???)
  Huft, tarik nafas dalam (jangan lupa keluarkan). Tak ada gunanya menyesali yang tlah terjadi. Mulai detik ini, anggap saja seperti pedekate lagi untuk memulai hubungan yang baru dengan si skripsi. Semoga Alloh memberikan kemudahan, kelancaran, keberhasilan, kesuksesan dan kebarokahan kepada kami dalam membina hubungan ini. Aamiiin. (mohon doanya juga ya, semuanyaaa^^). Dan dimulailah langkahku ini, step by step to S.Si. Bismillaah…