sudah satu minggu setengah aku kembali ke lab setelah sekian lamanya (hampir 8 bulan menunda penelitian) dan memulai rutinitas: berangkat pagi (sekitar jam set8 dan sampai ke lab jam 8 an) dengan berjalan kaki dulu sampe pertigaan trus nek angkot bayar ongkos 2.500 dan jalan lagi dr depan gerbang sampe lab melewati hutan belantara (lebay), di lab memasukkan dan mengolah data, membaca literatur, konsultasi (ngobrol biasa sih) dengan pembimbing di lab, solat di musola, makan di lab (kalo bawa bekel) atau di kantin lab, pulang sore-sore (sekitar jam4an,dan hampir selalu hujan minimal gerimis).
dan besok aku sudah ditagih oleh pembimbingku untuk menyerahkan draft skripsi ku!!! hwaa.....(selalu begini, ga bljar dr pengalaman ni)
mski belum sempurna, aku bagi sebagian draft skripsiku ya..
OPTIMASI
PRODUKSI OLIGOSAKARIDA DARI PATI UMBI TACCA MENGGUNAKAN Brevibacterium
sp.
FEBY HERYANI PUTRI
DEPARTEMEN
BIOKIMIA
FAKULTAS
MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT
PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara agraris yang kaya akan hasil alam termasuk
tanaman pangan. Tanaman pangan ini dimanfaatkan untuk kebutuhan konsumsi
makhluk hidup. Pengembangan pertanian saat ini tidak hanya berorientasi pada peningkatan
produksi, tetapi juga pada produktivitas dan nilai tambah bahan pangan
tersebut. Umbi Tacca (Tacca leontopetaloides) adalah salah satu tanaman
pangan sumber karbohidrat alternatif yang banyak ditemui tumbuh liar di seluruh
wilayah pesisir Indonesia, misalnya di daerah pesisir Garut Selatan dengan nama
lokal jalawure, dan di daerah Kabupaten Kepulauan Talaud khususnya Kecamatan
Nanusa, Sulawesi Utara dengan nama lokal anuwun. Umbi Tacca ini tidak dapat
langsung dikonsumsi karena pada umbi terdapat senyawa rasa pahit yang yang
mengandung Taccaline. Selain itu, pengembangan umbi Tacca
ini juga masih sangat terbatas. Masyarakat disekitarnya hanya mengonsumsi umbi Tacca
sebagai bahan pangan alternatif pengganti beras, dan tepung Tacca digunakan
untuk membuat berbagai jenis kue, baik kue kering maupun kue basah (Aatjin 2012).
Umbi Tacca
mengandung 74.8% karbohidrat, 66.65% pati, 22.7% amilosa dan 43.88% amilopektin
(Aatjin 2012). Pati yang dikandung oleh umbi Tacca ini berpotensi untuk
menghasilakan oligosakarida melalui proses hidrolisis enzimatik. Dengan
mengubah terlebih dahulu pati menjadi oligosakarida, nilai jual umbi Tacca akan
semakin tinggi.
Oligosakarida
memiliki fungsi penting bagi kesehatan makhluk hidup seperti meningkatkan
populasi bakteri baik di saluran cerna, mereduksi reaksi alergi, meningkatkan
penyerapan mineral, dan memodulasi metabolisme lipid. Oligosakarida juga
merupakan bahan makanan yang memiliki potensi yang besar untuk meningkatkan
kualitas berbagai makanan (Nakakuki 2002). Oligosakarida dapat digunakan
sebagai prebiotik untuk ternak dan zat pemacu pertumbuhan alternaif yang aman
sebagai pengganti antibiotik pada unggas (Haryati 2010; Nurmeiliasari 2008)
Oligosakarida juga berperan prebiotik dalam meningkatkan imunitas.
Tidak terdegradasi oleh enzim endogenus yang dihasilkan organisme inang. Tidak
dicerna dan tidak diserap sehingga menurunkan asupan energi dalam pencernaan
dan menurunkan pengeluaran insulin, akan tetapi dengan mudah difermentasi oleh Bifidobacteria
yang ada dalam saluran pencernaan dan menghasilkan SCFA yang akan
menurunkan pH usus sehingga persentase bakteri menguntungkan meningkat,
sedangkan persentase bakteri pembusuk yang merugikan menurun. Hasil fermentasi
mikrobial dari oligosakarida ini mempunyai pengaruh yang menguntungkan terhadap
proliferasi sel dari dinding mukosa usus, menunjukan sifat antiradang dan
aktifitas antitumor serta meningkatkan aktifitas motorik usus. Dengan demikian
populasi bakteri gram negatif dapat menurun (Oyofo et al., 1989; Bayley et
al., 1991; Waldroup et al., 1993).
Produksi
oligosakarida dapat dilakukan dengan cara menghidrolisis pati. Pati dapat
dihidrolisis dengan asam (non enzimatis) atau dengan enzim (enzimatis).
Hidrolisis dengan asam memiliki beberapa kelemahan, yaitu metode ini harus
dilakukan pada medium yang sangat asam (pH 1-2), suhu yang tinggi (150-230°C),
dan tekanan yang tinggi. Sebagai akibat dari proses termal, hidrolisis secara
asam menghasilkan proses samping yang mengkontaminasi hidrolisat produksi
akhir. Sedangkan hidrolisis enzimatik dilakukan pada kondisi yang lebih lembut,
yaitu temperature yang lebih rendah (dibawah 100°C), tekanan normal, pH sedang
(6-8), dan memiliki kecepatan reaksi yang tinggi (Kolusheva dan Marinova 2006).
Kebanyakan hidrolisis enzimatik menggunakan enzim α-amilase dari berbagai
sumber yang berbeda, salah satunya yaitu dari Brevibacterium sp.. Brevibacterium
sp. adalah mikroba laut yang merupakan bakteri gram negatif, bersifat aerobik
dan dapat menghasilkan amilase pada kondisi suhu ruang serta pH 8 (Rahmani
2011).
Proses
hidrolisis enzimatik dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu enzim, konsentrasi
substrat, suhu, pH, waktu hidrolisis, perbandingan enzim dan substrat serta
pengadukan (Purba 2009). Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan optimasi
hidrolisis enzimatis pati umbi Tacca menggunakan amilase dari Brevibacterium
sp. untuk menghasilkan oligosakarida dengan menggunakan beberapa parameter,
yaitu konsentrasi substrat, perbandingan konsentrasi enzim dan konsentrasi
substrat, serta waktu hidrolisis. Hasil hidrolisis tersebut selanjutnya
dianalisis gula total, gula pereduksi, TLC dan HPLC.
Tujuan
penelitian ini yaitu menentukan kondisi optimum reaksi hidrolisis pati umbi Tacca
untuk menghasilkan oligosakarida yang pada jangka panjangnya oligosakarida ini dapat
dimanfaatkan sebagai prebiotik. Adapun hipotesis dari penelitian ini adalah
oligosakarida dapat dihasilkan dari pati umbi Tacca hasil hidrolisis dengan
amilase dari Brevibacterium sp. Penelitian ini diharapkan dapat
memberikan pengetahuan dan nilai guna mengenai manfaat pati umbi Tacca dan
produk turunannya berupa oligosakarida yang bernilai jual tinggi dan berfungsi
sebagai komponen pangan sehat seperti prebiotik.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan utama
yang digunakan sebagai substrat yaitu pati hasil ekstraksi umbi Tacca berumur 9
bulan yang berasal dari Hutan Jati yang tumbuh di Desa Palemahan, Pantai Siung,
kawasan Gunung Kidul, Jawa Tengah. Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam
pembuatan media peremajaan, pertumbuhan, dan produksi enzim amilase ekstrak
kasar yaitu Artificial Sea Water (ASW), yeast extract, pepton,
pati komersial, akuades, agar, dan isolat Brevibacterium sp. yang
merupakan koleksi bakteri laut di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat
penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong Bogor. Bahan-bahan lain yang digunakan
untuk analisis kimia yaitu buffer fosfat pH 6.6 (0.2 M), pereaksi DNS (DNS,
NaOH, Na-K tartrat), fenol 5% (b/v), H2SO4 pekat, n-butanol, asam
asetat, α-difenilamin, aseton, asam fosfat, dan anilin.
Alat-alat yang
digunakan untuk pembuatan media peremajaan dan pertumbuhan bakteri yaitu
erlenmeyer, cawan petri steril, magnetic stirrer, jarum ose steril,
bunsen, laminar dan plastik wrap. Alat-alat yang digunakan untuk
produksi enzim amilase yaitu erlenmeyer, inkubator goyang, sumbat kapas, dan hot
plate. Selain itu alat-alat yang digunakan untuk analisis kimia yaitu
tabung reaksi, rak tabung, microtube ependorf, pipet mikro, sentrifus, stopwatch,
waterbath, kuvet, spektrofotometer uv-vis, autoklaf, Kromatografi Lapis
Tipis (Thin Layer Chromatography, TLC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(High Performance Liquid Cromatography, HPLC).
Metode
Produksi enzim
amilase ekstrak kasar (Rahmani et al. 2011)
Pembuatan media peremajaan dan kultur penumbuhan bakteri
Pembuatan media
diawali dengan menyiapkan bahan penyusun media peremajaan dan kultur bakteri
terlebih dahulu yang terdiri dari 38 g/l Artificial Sea Water (ASW), 2%
pati komersial, 1.5% agar, 1 g/l yeast extract dan 5 g/l pepton. Media
tersebut disterilisasi pada 121°C selama 15 menit. Peremajaan bakteri dilakukan
pada cawan petri steril, sedangkan kultur pertumbuhan bakteri dilakukan pada
media cair. Bahan yang digunakan pada media peremajaan dan kultur pertumbuhan
bakteri hampir sama, hanya saja agar tidak ditambahkan pada media kultur
pertumbuhan.
Peremajaan dan proses kultur bakteri
Peremajaan
bakteri, dalam hal ini Brevibacterium sp. dilakukan dengan menggoreskan
isolat bakteri menggunakan jarum ose steril pada media padat yang telah
disiapkan. Media tersebut mengandung komponen nutrisi dan sumber karbon bagi
pertumbuhan isolat bakteri. Sebelum melakukan penanaman, laminar tempat kerja
disinari sinar UV terlebih dahulu selama 15 menit untuk membunuh mikroorganisme
yang tidak diinginkan sehingga dapat menurunkan risiko kontaminasi sebelum
penanaman. Media yang telah ditanami isolat diinkubasi pada suhu 30°C selama 3
hari.
Setelah itu
dilakukan prekultur dan kultur isolat bakteri pada media cair. Prekultur
dilakukan dengan memindahkan sebanyak 1 ose koloni tunggal bakteri ke dalam 20
ml media cair. Tujuan prekultur yaitu sebagai tahap adaptasi bakteri terhadap
media pertumbuhan sebelum dilakukan kultur pada volume yang lebih besar yaitu
180 ml media cair. Prekultur diinkubasi pada inkubator goyang 150 rpm, 30°C
selama 3 hari. Selanjutnya dilakukan proses kultur pada kondisi yang sama
seperti pada prekultur. Satelah hari ke-4 kultur siap dipanen.
Preparasi enzim amilase ekstrak kasar
Amilase ekstrak
kasar didapatkan dari ekstraksi kultur sel dengan cara sentrifugasi pada
kecepatan 6764xg rpm selama 15 menit. Ekstrasi enzim amilase dipertahankan pada
suhu dingin yaitu minimal 4°C (Liu et al. 2011) untuk menjaga aktifitas
enzim. Hasil ekstraksi enzim (supernatan) yang diperoleh merupakan amilase
ekstrak kasar yang siap digunakan untuk proses hidrolisis.
Analisis aktivitas amilase ekstrak kasar (modifikasi Bernfeld 1995)
Aktivitas enzim
amilase ditentukan dengan menggunakan metode DNS yang telah dimodifikasi
(Bernfeld 1995) dengan mereaksikan 0.5 ml enzim yang telah diencerkan dengan
faktor pengenceran tertentu dan 0.5 ml larutan pati 0.5% (b/v) dalam buffer
fosfat pH 6.6 (0.2 M), kemudian
diinkubasi 30°C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan merendam tabung
reaksi berisi sampel dalam air mendidih 100°C selama 20 menit. Gula pereduksi
yang dibebaskan ditentukan dengan menggunakan metode DNS (Miller 1959). Warna
yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
Nilai absorbansi yang diperoleh dikonversi
menjadi konsentrasi gula pereduksi (ppm) menggunakan persamaan yang
didapat dari kurva standar glukosa. Satu unit aktivitas enzim (U) merupakan
jumlah enzim yang mampu mengkatalis perubahan 1 µmol substrat per menit pada
keadaan pengukuran optimal (Lehninger 2008). Rumus:
Penentuan kondisi hidrolisis enzimatis pati umbi Tacca (Rahmani
2013)
Tahap ini
merupakan tahap penentuan kondisi produksi oligosakarida dengan menggunakan
enzim amilase ekstrak kasar. Terdapat tiga variabel yang harus ditentukan yaitu
konsentrasi substrat b/v (1.5; 3; 4.5; 6; 7.5)%, perbandingan enzim-substrat
v/v (1:1; 1:5; 1:10), serta waktu reaksi hidrolisis enzimatis (jam ke-1; 2; 4; 6;
8). Penentuan kondisi tersebut dilakukan secara bertahap. Konsentrasi substrat
ditentukan terlebih dahulu. Setelah diperoleh konsentrasi substrat yang optimum,
dilanjutkan dengan penentuan perbandingan enzim-substrat. Adapun penentuan
waktu optimum rekasi hidrolisis dilakukan dengan pengambilan sampel pada jam
ke-1, 2, 4, 6, dan 8.
Proses reaksi
hidrolisis enzimatis dilakukan dengan cara membuat larutan substrat terlebih
dahulu menggunakan pelarut akuades, lalu dipanaskan pada suhu 80°C selama 10
menit dan didiamkan hingga suhunya mencapai 30°C. Selanjutnya dilakukan
penambahan amilase ekstrak kasar sebanyak 1 ml dan disimpan pada inkubator
goyang 150 rpm pada suhu tertentu. Pengambilan sampel dilakukanpada jam ke-1,
2, 4, 6, dan 8. Sampel dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit, dan
didiamkan hingga suhunya 27°C, lalu sentrifugasi pada kecepatan 6764xg rpm
selama 15 menit dan supernatan yang dihasilkan selanjutnya dianalisis gula
pereduksi, gula total, KLT dan KCKT.
Analisis kimia
Analisis gula total (modifikasi Dubois et al. 1956)
Analisis gula
total ditentukan dengan menggunakan metode fenol-asam sulfat yang telah
dimodifikasi (Dubois et al. 1956). Larutan glukosa standar masing-masing
sebanyak 0.5 ml dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200 ppm dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, begitu juga sampel hasil hidrolisis. Sebanyak 0.5 ml larutan
fenol 5% (b/v) dan 2.5 ml asam sulfat pekat ditambahakn ke dalam larutan
standard an sampel kemudian diinkubasi pada suhu 40°C selama 20 menit. Setelah
itu absorbansi diukur pada panjang gelombang 490 nm.
Analisis gula pereduksi (modifikasi Miller 1959).
Jumlah gula
pereduksi yang terbentuk ditentukan dengan metode DNS yang telah dimodifikasi
(Miller 1959). Sebanyak 0.5 ml larutan standar glukosa dengan konsentrasi 50,
100, 150, 200, 250, 500 ppm yang telah diencerkan dari 1000 ppm dimasukkan ke
dalam tabung reaksi dan ditambah 0.75 ml pereaksi DNS, begitupun sampel hasil
hidrolisis. Larutan standar sampel dimasukkan ke dalam waterbath 100°C
selama 20 menit kemudian didiamkan sampai suhunya mendekati suhu ruang. Setelah
itu dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.
Kromatografi Lapis Tipis (Rahmani 2013)
Kromatografi
Lapis Tipis digunakan secara kuantitatif untuk melihat jenis oligosakarida yang
terbentuk. Analisis ini dilakukan pada plat silika gel 60 F254 (Merck
art 20-20 cm) sebagai fase diam. Plat tersebut dibuat dengan ukuran 10 cm x 10
cm, garis start 1 cm dari batas bawah dan garis finish 0.5 cm dari batas atas.
Sampel diteteskan sebanyak 8 kali menggunakan pipa kapiler dengan jarak 1 cm
antara sampel. Plat dimasukkan ke dalam bejana pengembang berisi eluen yang
telah dijenuhkan selama 1 jam. Eluen tersebut terdiri dari n-butanol:asam
asetat:akuades dengan perbandingan 12:6:6 (ml). Elusi dilakukan hingga garis
finish. Plat diangkat hingga eluen menguap semua pada suhu kamar lalu disemprotkan dengan pewarna gula (0.5 gram
α-difenilamin, 25 ml aseton, 2.5ml asam fosfat, 0.5 ml anilin pada erlenmeyer
300 ml). Plat dikeringkan didalam oven 100°C selama 15 menit hingga terbentuk
spot. Setelah dingin diukur nilai Rf dari masing-masing komponen. Nilai Rf
adalah perbandingan tinggi spot pada plat silika gel dengan tinggi larutan
pengembang. Rumusnya yaitu:
Analisis profil oligosakarida menggunakan KCKT
Oligosakarida
hasil hidrolisis enzimatis dianalisis secara kualitatif maupun kuantitatif
menggunakan KCKT. Detektor yang digunakan yaitu Refractive Index Detector (RID)
dan kolom Zorbax SIL (silika) dengan dilapisi 3-aminopropilsilen. Fase gerak
yang digunakan adalah asetonitril dan akuades dengan rasio 75:25 (v/v) yang
telah di-degassing. Kecepatan alir dan suhu yang digunakan adalah 1.4 ml/menit
dan 30°C (Lee et al. 2003, Kandra et al. 2002).